甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术

　　一、技术概述

　　（一）技术基本情况

　　甘蔗是我国主要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的87%。我国食糖供应自给率大约为67%，保障食糖供给安全关系国计民生。甘蔗是无性繁殖作物，常受病原物反复侵染、并在植株体内不断积累，容易造成甘蔗品种种性退化，生活力和抗病性下降，严重威胁我国甘蔗产业可持续发展。甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术是针对我国蔗区危害较大病毒病、宿根矮化病、赤条病等重要病原物开展诊断鉴定，系统建立有效的分子诊断检测技术，开发成套的高效、灵敏、快速的诊断试剂，通过集成创新不断完善检测技术手段和方法，制定相关的国家标准，建立我国标准化检测、监控体系。该技术解决了我国甘蔗主要病害检测、甘蔗健康种苗质量监控中的关键技术问题，在甘蔗病害发生监测与预警、甘蔗健康种苗检测、病害抗性鉴定等方面得到广泛应用，采用该标准的机构有科研、教学、推广、生产、质检等部门和单位。

　　（二）技术示范推广情况

　　甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术适用于可能带有甘蔗黄叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒、甘蔗杆状病毒、甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗赤条病菌的活体寄主植物的快速检测、诊断。在国家标准化管理委员会、国家糖料产业技术体系和各省（区）高等院校、科研单位、农业推广部门、行业学会等单位的大力支持下，通过技术培训、讲座、现场指导，结合发放标准单行本等方式，该标准在福建、广西、广东等7个省（区）积极得到推广应用和贯彻实施。在中国作物学会甘蔗专业委员会学术讨论会、全国甘蔗提质增效关键技术培训班、现代甘蔗产业发展高级研修班暨区试经验交流会等活动上，通过专题报告和墙报等形式对相关科技人员进行标准的推广和培训，推动检测技术在福建省以及其他省（区）蔗区宣贯实施。同时，在甘蔗（果蔗）脱毒种苗研发和生产单位开展脱毒种苗病原检测和质量监控技术培训，该标准已在多家单位推广应用，生产的合格脱毒种苗和种茎辐射到闽、桂、滇、粤、琼、浙、川等7个省（区）蔗区。

　　该套技术体系被国家糖料产业技术体系、农业农村部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、广西甘蔗生物学重点实验室、来宾市农业科学院、云南省农业科学院、内江市农业技术推广服务中心、浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所、福建省种植业技术推广总站、广西农垦金光农场有限公司等多家质检机构、科研教学单位、农业推广部门和种苗企业认可并采用，已在甘蔗病害检测和监测、脱毒种苗质量监控、甘蔗抗病性鉴定等方面得到广泛应用。

　　（三）提质增效情况

　　甘蔗（果蔗）是无性繁殖作物，加上蔗区栽培品种单一化严重，病毒容易反复侵染，并在植株体内不断积累，导致种性退化严重，抗病性降低，从而引起甘蔗（果蔗）产量下降、品质变劣。近年来，甘蔗病毒病、宿根矮化病、赤条病等病害在我国蔗区频繁发现，并且在部分蔗区成为主要病害，影响着甘蔗糖产业持续、健康、稳定的发展。采用甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术在广西、广东、云南3个省（区）开展了甘蔗主要病害检测和监测，有效地降低了甘蔗花叶病、甘蔗宿根矮化病等主要病害的发生和流行，挽回蔗茎产量损失24.88万吨以上，其推广应用累计达11.30万公顷，新增农业效益2.29亿元，新增工业效益1.76亿，新增利润0.48亿元。在福建、浙江、四川3个省份果蔗种植区推广应用累计达1.22万公顷，提高果蔗产量达7.01万吨，新增农业经济效益1.29亿元。

　　甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术的实施为甘蔗脱毒种苗示范和推广计划提供了重要的技术支撑。采用该技术对生产的脱毒种苗和种茎的质量进行监控，生产的合格脱毒种苗和种茎具有生长速度快、分蘖力强、成茎率高、产量高、用种量少、延长宿根年限、抗逆性能好等优点，可加速甘蔗良种快速繁殖，提高蔗糖分含量，增产效果显著。该技术已用于海南、广西等蔗区脱毒种苗检测，生产合格的脱毒种苗和种茎辐射桂、粤、滇等蔗区，应用面积1.47万公顷，新增农业效益0.17-0.25亿元。

　　甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术的实施为我国甘蔗主要病害的诊断和抗性鉴定、流行监测和绿色防控、甘蔗引种检验检疫、抗性评价和脱毒种苗质量市场监管提供重要的技术手段，对提高我国甘蔗产业的国际市场竞争力，实现农药减施增效、农业绿色发展，保障国家食糖安全，推进甘蔗产业的高质量发展具有重要经济、社会和生态效益。

　　（四）技术获奖情况

　　甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术中的核心科技成果“GB/T28067-2011甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法”和“GB/T36820-2018甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法”2个国家标准分别于2015年、2020年获福建省标准贡献奖三等奖。

　　二、技术要点

　　甘蔗脱毒健康种苗质量监控技术以我国蔗区主要甘蔗病害为研究对象，建立病毒病、宿根矮化病、赤条病等重要病原物诊断检测体系，取得创新性突破，搭建了5种甘蔗病原监测预警技术平台，并在我国甘蔗主要蔗区开展集成与示范，成效显著。关键核心技术主要内容如下：

　　（一）建立甘蔗黄叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测技术体系，形成“GB/T 28067-2011甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法”国家标准。该标准是基于SCYLV外壳蛋白基因保守区序列，设计一套荧光定量RT-PCR检测的引物及TaqMan探针，建立了SCYLV实时荧光定量RT-PCR检测技术体系，为病毒的检验检疫提供了准确可靠、灵敏快速的检测技术规范，适用于甘蔗植株、种苗（含脱毒苗）及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断。该技术体系检测下限为初始质粒模板DNA 1000拷贝/µL（约3.61 fg/µL），比常规PCR方法的灵敏度提高100倍，比酶联免疫吸附实验（ELISA）、组织印迹杂交（TBIA）具有更高的灵敏度，具有良好的重复性和特异性。该检测关键技术参数——特异性引物和荧光双标记TaqMan探针能够有效地检测当前报道的所有甘蔗黄叶病毒基因型。

　　（二）建立甘蔗条纹花叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测技术体系，形成“GB/T 36820-2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法”国家标准。该标准基于SCSMV外壳蛋白（CP）基因保守区序列，设计一套荧光定量RT-PCR检测的引物及TaqMan探针，建立了SCSMV实时荧光定量RT-PCR检测技术体系，为国内外首次报道，为SCSMV分子鉴定、流行监测和隔离检验检疫提供技术规范，适用于甘蔗植株、种苗（含脱毒苗）及种茎等活体寄主的SCSMV的快速检测、诊断。该技术体系检测下限为初始RNA模板100拷贝、叶片总RNA模板2 pg，比常规PCR方法的灵敏度提高100倍，具有灵敏、快速、特异性强和重复性好等优点。该标准关键技术参数——特异性引物和荧光双标记TaqMan探针能够对当前SCSMV所有基因型（株系）有效检测。

　　（三）建立甘蔗杆状病毒实时荧光定量PCR检测技术体系，形成GB/T 36806-2018甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法”国家标准。该标准基于2个不同SCBV病毒种（SCBIMV和SCBMOV）RT/RNase H保守区域，分别设计2对特异性引物和2条特异性荧光双标记TaqMan探针，建立SCBV实时荧光PCR检测方法体系，具有灵敏度高、特异性强和操作简单等优点，已广泛应用于甘蔗病害的检测和监测，该国家标准的贯彻实施和推广应用，推动甘蔗产业绿色发展具有重要意义。

　　（四）建立甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测技术体系，形成“GB/T 36829-2018甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法”国家标准。该标准根据甘蔗宿根矮化病菌的致病基因Pat1设计了一套检测引物与TaqMan探针，建立qPCR检测体系，对病原菌基因组DNA和质粒DNA的最低检测限分别为100 fg/μL和100拷贝/μL，比常规PCR检测方法提高100倍。

　　（五）建立甘蔗赤条病菌实时荧光定量PCR检测技术体系，形成“一种分子检测和鉴定甘蔗赤条病菌不同株系的试剂盒（ZL201610686714.1）”国家发明专利。本研究根据甘蔗赤条病菌16S~23S核糖体基因及其转录间隔区ITS分别设计2对引物，建立甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，最低检测限分别为10 fg/μL叶片总DNA、10拷贝/μL细菌基因组DNA和36 CFU/mL悬浮细胞，是常规PCR灵敏度的1000倍；将巢式PCR检测方法和限制性内切酶切条带长度多态性（RFLP）结合，研发了一种快速检测鉴定甘蔗赤条病菌的试剂盒及其检测方法。

　　综上，这5种甘蔗病原的检测技术的构建，为我国甘蔗主要病害的诊断和抗性鉴定、流行监测和绿色防控、甘蔗引种检验检疫、抗性评价和脱毒种苗质量市场监管提供重要技术和平台，特别是在甘蔗脱毒种苗的生产、繁育过程的甘蔗脱毒种苗检测环节发挥重要作用，以确保健康种苗质量标，为实施国家甘蔗脱毒种苗推广计划的质量监控提供关键技术支撑。

　　三、适宜区域

　　福建、广西、广东、云南、海南、四川、贵州

　　四、注意事项

　　实时荧光检测技术具有高度的灵敏度，容易受外界条件影响，造成交叉污染，因此实时荧光检测实验室要求比一般生理生化实验室高。

　　五、技术依托单位

　　福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心

　　联系地址：福州市仓山区上下店路 15 号

　　邮政编码：350002

　　联 系 人：高三基

　　联系电话：83851742；

　　电子邮箱：gsanji@163.com